Sekwencjonowanie 16S, 18S i 26S rRNA jest szeroko stosowane w badaniach mikrobiomów do identyfikacji składu bakterii, grzybów i pierwotniaków w różnorodnych mikrobiomach, od jelita człowieka po las deszczowy Amazonii. Odczytane sekwencje DNA ,kodujących całe podjednostki rybosomu 16S, 18S i 26S rRNA, umożliwia rozpoznanie każdego opisanego gatunku mikroorganizmu.
Spis treści:
Do czego służy sekwencjonowanie genów kodujących rRNA?
Zasady sekwencjonowania 16S rRNA
Etapy sewkencjonowania 16S, 18S i 26S rRNA
Sekwencjonowanie 16S
Analiza danych
Do czego służy sekwencjonowanie genów kodujących rRNA?
Sekwencjonowanie genów kodujących rRNA jest metodą badawczą i diagnostyczną wykorzystywaną do identyfikacji mikroorganizmów (m.in. bakterii, grzybów, pasożytów) w próbce biologicznej. Jest to jedyna metoda umożliwiająca równoczesne zidentyfikowanie wszystkich mikroorganizmów w próbce, stąd liczne i ciągle rosnące zastosowania tej metody:
Mikrobiologia środowiskowa:
Sekwencjonowanie genów kodujących rRNA jest stosowane do identyfikacji i klasyfikacji mikroorganizmów obecnych w próbkach gleby, wody i powietrza, dostarczając informacji na temat różnorodności mikroorganizmów w tych środowiskach w celu oceny zanieczyszczenia, skażenia lub profilu mikrobiomu.
Mikrobiologia medyczna:
Sekwencjonowanie genów kodujących rRNA jest używane do identyfikacji i klasyfikacji mikroorganizmów w próbkach klinicznych, takich jak te pobrane z mikrobiomu człowieka w tym próbki stolca (mikrobom jelitowy), płyny ustrojowe (mocz, plwocina, krew) w tym wszelkie wymazy. Metoda umożliwia diagnostykę i leczenie infekcji trudnych lub niewykrywalne standardowymi metodami mikrobiologicznymi (posiewy mikrobiologiczne lub diagnostyka PCR). Metoda dostarcza informacji na temat roli mikrobiomu w zdrowiu i chorobie. Stan i zróżnicowanie mikroflory jelitowej jest kluczowe dla monitorowania chorób przewodu pokarmowego w tym nietolerancji pokarmowych i zaburzeń odżywiania. Przykłady zastosowań:
1. Kał – materiał ten jest często wykorzystywany w badaniach mikrobiomu jelitowego, ponieważ zawiera całą gamę mikroorganizmów zasiedlających przewód pokarmowy.
2. Mocz – badanie moczu może pomóc w diagnozowaniu chorób układu moczowego, takich jak infekcje dróg moczowych, a także innych chorób układu moczowopłciowego.
3. Płyny ustrojowe – płyny takie jak krew, płyn mózgowo-rdzeniowy czy płyn stawowy mogą być wykorzystane w diagnostyce chorób związanych z układem krążenia, neurologicznych czy reumatologicznych.
4. Wymazy – w zależności od lokalizacji, można zbierać wymazy z różnych części ciała, takich jak gardło, nos, skóra czy narządy płciowe. Wymazy takie mogą pomóc w diagnostyce chorób zakaźnych, takich jak angina, zapalenie zatok czy choroby przenoszone drogą płciową.
5. Analiza mikrobiomu endometrium – polega na badaniu składu mikroorganizmów obecnych w błonie śluzowej macicy. Jest to szczególnie przydatne w diagnostyce chorób związanych z układem rozrodczym, takich jak niepłodność, infekcje dróg rodnych czy zaburzenia hormonalne. Próbki do analizy pobiera się za pomocą wymazów lub biopsji endometrium.
6. Analiza mikrobiomu nasienia – polega na identyfikacji i analizie mikroorganizmów obecnych w nasieniu. Jest to ważne zarówno w kontekście rozrodczości, jak i zdrowia ogólnego. Badanie mikrobiomu nasienia może pomóc w diagnozowaniu chorób prostaty, niepłodności męskiej oraz ocenie jakości nasienia. Próbki do analizy pobiera się poprzez ejakulację lub za pomocą biopsji nasieniowodów.
Mikrobiologia prozdrowotna:
Sekwencjonowanie genów kodujących rRNA zapewnia unikalną możliwość uzyskania szczegółowej analizy mikroflory jelitowej i innych mikroorganizmów obecnych w Twoim organizmie poprzez sekwencjonowanie genów rRNA. Główne korzyści to :
7. Szczegółowe zrozumienie swojej mikroflory jelitowej: Dzięki analizie sekwencji genów rRNA, poznasz mikroorganizmy obecne w Twoim układzie pokarmowym. Dowiesz się, jakie bakterie i inne mikroorganizmy występują w Twoim jelicie, co może wpływać na Twoje zdrowie i procesy trawiennego.
8. Identyfikacja potencjalnych zagrożeń: Nasza analiza pozwala wykryć ukryte patogeny, które mogą być obecne w Twoim organizmie. Dzięki temu będziesz mieć informację o ewentualnych infekcjach lub innych zagrożeniach, które mogą wymagać dalszej diagnostyki i leczenia.
9. Personalizacja diety i stylu życia: Na podstawie wyników analizy, nasz zespół ekspertów pomoże Ci zinterpretować rezultaty i dostarczy Ci spersonalizowane rekomendacje. Będziesz wiedział/a, jak dostosować swoją dietę, wprowadzić odpowiednie suplementy i zmienić styl życia w celu wspierania zdrowej mikroflory jelitowej i ogólnego stanu zdrowia.
Nasza oferta opiera się na najnowszych osiągnięciach nauki i technologii, aby zapewnić Ci pełną i precyzyjną analizę mikroflory jelitowej. Dzięki temu będziesz mógł/mogła podjąć świadome decyzje dotyczące swojego zdrowia i zwiększyć szanse na osiągnięcie optymalnego stanu zdrowia i dobrego samopoczucia.
Mikrobiologia żywności:
Sekwencjonowanie genów kodujących rRNA może być również używane do identyfikacji i klasyfikacji mikroorganizmów obecnych w produktach spożywczych, takich jak produkty fermentowane i napoje, w celu zapewnienia bezpieczeństwa i jakości żywności. Może również służyć do wykrywania i identyfikacji patogenów przenoszonych przez żywność.
Mikrobiologia przemysłowa:
Sekwencjonowanie genów kodujących rRNA może być używane do identyfikacji i klasyfikacji mikroorganizmów obecnych w procesach przemysłowych, takich jak produkcja produktów biotechnologicznych, farmaceutycznych lub oczyszczanie ścieków.
Zasady sekwencjonowania 16S rRNA
Sekwencjonowanie pełnych fragmentów 16S, 18S i 26S rRNA jest formą sekwencjonowania ampliconów, rodzajem sekwencjonowania genomowego, które skupia się na wysoko specyficznych regionach w obrębie genomu. Geny rRNA to niewielkie, konserwowane geny, kodujące podjednostki rybosomu 16S, 18S i 26S. Gen 16S rRNA występuje we wszystkich bakteriach i archeach,, co czyni go idealnym celem do identyfikacji i charakteryzacji tych mikroorganizmów. Ponadto, w obrębie tych genów występują regiony o dużej zmienności, które są przydatne do różnicowania między poszczególnymi gatunkami i szczepami bakterii. Sekwencjonowania ampliconów 18S i 26S, fragmentów unikalnych dla organizmów jądrowych. skupiają się na rozpoznawaniu grzybów, pierwotniaków i pasożytów.
Etapy sekwencjonowania 16S, 18S i 26S rRNA
Przygotowanie próbki
Jak we wszystkich badaniach mikrobiomu, zebranie i przechowywanie próbki ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych, wiarygodnych i powtarzalnych wyników sekwencjonowania genów kodujących rRNA. Próbki mogą być pobierane na różne sposoby, w zależności od tego, czy są to próbki kału ludzkiego, próbki gleby, próbki wody, wymazy lub inne rodzaje próbek.
Przed ekstrakcją DNA z próbki może być konieczne przetworzenie próbki wstępne w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń lub substancji hamujących, które mogą zakłócić proces ekstrakcji. Może to obejmować dodanie enzymów do rozkładu ścian komórkowych, stosowanie ciepła do denaturacji białek lub stosowanie metod fizycznych do oddzielenia komórek od zanieczyszczeń.
Ekstrakcja DNA
Po zebraniu i przygotowaniu próbki następnym krokiem jest ekstrakcja DNA z mikroorganizmów w próbce. Zazwyczaj odbywa się to za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA, który wykorzystuje kombinację metod chemicznych i fizycznych do oddzielenia DNA od innych składników komórkowych. Istnieje wiele różnych zestawów do ekstrakcji DNA, a wybór zestawu zależy od rodzaju analizowanej próbki i konkretnych celów eksperymentu. Wszystkie zestawy do ekstrakcji DNA obejmują następujące kroki:
Liza: Liza polega na rozerwaniu komórek i ich jąder w celu uwolnienia zawartości, w tym DNA. Zazwyczaj odbywa się to za pomocą procesów chemicznych (dodawanie enzymów) i mechanicznych (wstrząsanie/mieszanie).
Precypitacja: Po rozerwaniu komórek konieczne jest oddzielenie DNA od pozostałych składników komórkowych. Dzieje się to poprzez dodanie roztworu soli i alkoholu.
Oczyszczanie: Wyizolowane DNA jest następnie płukane w celu usunięcia innych zanieczyszczeń, a następnie rozpuszczone w roztworze wodnym.
Przygotowanie biblioteki
Przygotowanie biblioteki odnosi się do serii kroków koniecznych do przygotowania DNA do sekwencjonowania. Obejmuje ono następujące czynności:
Amplifikacja genów 16S, 18S i 26S rRNA: Po ekstrakcji DNA następnym krokiem jest amplifikacja genów za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). W tym celu konieczne jest użycie starterów, które specyficznie wiążą się np. z genem 16S rRNA i amplifikują go w całości (~1550 bp).
Wykonanie PCR w celu dodania molekularnych „kodów kreskowych” do każdej oczyszczonej próbki DNA (jeśli sekwencjonowane jest więcej niż jedna próbka). Najczęściej jednocześnie analizuje się więcej niż jedną próbkę, dlatego konieczne jest dodanie molekularnych kodów kreskowych do każdej próbki, aby po sekwencjonowaniu można było zidentyfikować, które odczyty należą do której próbki.
Oczyszczenie DNA: W celu usunięcia zanieczyszczeń, które mogą zakłócać sekwencjonowanie oraz usunięcia fragmentów DNA, które są zbyt małe lub zbyt duże, ważne jest oczyszczenie DNA. Zazwyczaj wykonuje się to za pomocą magnetycznych mikrokulek o określonym stężeniu, które wiążą DNA o odpowiednim rozmiarze, ale nie wiążą innych zanieczyszczeń.
Sekwencjonowanie 16S
Po przygotowaniu biblioteka jest gotowa do sekwencjonowania. Istnieje wiele różnych platform sekwencjonujących a ich wybór zależy od konkretnych celów eksperymentu oraz dostępności sprzętu i zasobów. Platformy II generacji to m.in. Illumina oraz Ion Torrent, ta metoda sekwencjonuje jednie wybrane fragmenty genów do długości 400-500bp. Najnowsze platformy, Oxford Nanopore i PacBio, umożliwiają sekwencjonowanie III generacji. Ta metoda umożliwia sekwencjonowanie całych fragmentów genu 16s, 18s i 26s rRNA, co znacząco zwiększa dokładność analizy i umożliwia detekcje organizmów co najmniej na poziomie gatunku. Wynikowe dane generują sekwencje całych genów kodujących podjednostki rRNA, które można porównać z bazami danych, aby zidentyfikować, do jakich bakterii i archeów należą.
Analiza danych
Po zakończeniu sekwencjonowania, ostatnim krokiem jest analiza danych w celu zidentyfikowania i sklasyfikowania mikroorganizmów obecnych w próbce. Wykorzystuje się w tym celu narzędzia bioinformatyczne, które pomagają w oczyszczeniu danych sekwencjonowania poprzez usunięcie odczytów pochodzących od człowieka oraz błędów sekwencjonowania, a także wyrównaniu oczyszczonych odczytów do publicznych baz danych, takich jak baza danych Narodowego Centrum Biotechnologii (NCBI). Istnieje wiele dostępnych potoków bioinformatycznych do analizy sekwencjonowania 16S, 18S i 26S (QIIME, MOTHUR, BLAST, CENTRIFUGE), aby wspierać badaczy bez specjalistycznej wiedzy z zakresu bioinformatyki. Po przypisaniu odczytów sekwencji do baz danych za pomocą tych potoków, można zastosować różne podejścia statystyczne do oceny trendów i związków między różnymi próbkami.
